转基因食品中Btcry2Ab/2Ac杀虫蛋白直接竞争ELISA试剂盒的研制
顾炜炜, 潘家荣*
(农业部农业核技术与农产品加工重点实验室,
中国农业科学院农产品加工研究所, 北京100094)
Development of the detetion of ELISA kit for
Btcry2Ab/2Ac insecticidal protein in transgenic food
GU Wei- wei, PAN J ia- rong*
(Key Laboratory of Agricultural Nuclear Technology and Agro- Food Proces s ing of Minis try of
Agriculture, Ins titute of Agro- Food Science and Technology, Beijing 100094)
Abstr act: A ELISA kit based on polyclonal antibody was developed to detect the Btcry2A6/2Ac Insecticidal protein
in transgenic food. Linear detection of the kit covered a range from 40ng/mL to 2000ng/mL. The recoveries
of Btcry2Ab/2Ac insecticidal protein added to sample ranged from 98.52% to 102.27%. The mean within as say、between- as say variability ranged apart from 1.55% to 7.17% and 3.78% to7.39%. The validity of kit in 4℃ was
above s ix months .
Key words: transgenic food; Btcry2Ab/2Ac; insecticidal protein; ELISA kit
摘要: 研制了用于检测转基因食品中Btcry2Ab/2Ac杀虫蛋白的直接竞争ELISA试剂盒, 研究结果表明:
该试剂盒的最低检测限为40ng/mL, 线性检测范围为40～2000ng/mL, 回收率在98.52%～102.27%之间;
板内、板间变异系数分别在1.55%～7.17%和3.78%～7.39%之间; 试剂盒在4℃下至少可保存6个月以上。
关键词: 转基因食品; Btcry2Ab/2Ac; 杀虫蛋白; 试剂盒
中图分类号: TS201 文献标识码: A 文章编号: 1005- 9989(2007)06- 0203- 04
目前越来越多的国家要求对转基因产品实行标
签制度, 我国农业部也颁布了《农业转基因生物标
识管理办法》, 规定从2002年3月20日起, 凡是在中国
境内销售的大豆、玉米、棉花及其制品若属转基因
植物及其制品, 必须进行标识。因此对产品进行转
基因成分检测、确定是否含有、含量多少以及什么
种类的转基因产品是摆在各国政府面前一项亟待解
决的任务。转基因产品的检测方法要求快速、简便、
灵敏、可靠、适应样品量大等特点。目前国际社会对
转基因产品的检测主要采用的技术路线有两条[1- 5],
即检测插入基因和检测表达蛋白, 两种方法各有优
缺点。前者主要采用PCR扩增和核酸探针的杂交检测
技术; 后者主要采用化学分析、凝胶电泳和免疫检
测[6- 8]的方法。
本研究在酶标抗原和多克隆抗体的基础上, 研
制了检测Btcry2Ab/2Ac杀虫蛋白的直接竞争ELISA试
剂盒, 具有操作简便、灵敏度高、检测时间短等优
点, 可用于转基因食品的快速、大批量检测。同时它
对仪器设备要求相对低, 测定结果可以长期保存,
并且可以对转基因表达产物进行定量分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 化学试剂Btcry2Ab/2Ac杀虫蛋白、Btcry2Ab/
2Ac杀虫蛋白多抗: 自制; 牛血清白蛋白(BSA): 北京
元亨圣马生物技术研究所; 辣根过氧化物酶(HRP):
上海分装。
1.1.2 仪器设备酶标仪: MULTISKAN MK3, Thermo
ELECTRON CORPORATION; 电热恒温水温箱:
北京西城区医疗器械厂; 高速冷冻离心机: TGL-
16A, 长沙平凡仪器仪表有限公司; 紫外可见分光光
度计: 日立U- 3010/3310, 北京天美科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 直接竞争ELISA操作程序包被: 以包被酶标
板, 100μL/孔, 37℃水浴2h后转入4℃冰箱过夜, 第
二天取出洗板5次, 每次3min。加入1% BSA封闭,
150μL/孔, 37℃水浴2h, 同上洗板。加入50μL标样或
处理好的样品到各自孔中, 标样和样品各作3个重
复; 加入50μL稀释的酶标抗原, 37℃水浴1h, 同上
洗板。加入底物液, 37℃避光水浴20min。加入50μL2mol/L硫酸终止反应, 测定OD450。
1.2.2 Btcry2Ab/2Ac杀虫蛋白的酶标记: 采用改良的
简易过碘酸钠法[9]。
HRP的活化: 在试管中加入临时配制的0.1mol/L
pH9.2的碳酸盐缓冲液0.2mL, 与2mg HRP混合。加入
临时配制的NaIO4溶液0.2mL, 盖上试管盖, 20℃避光
反应2h;
偶联: 取抗原溶液1mL, 将活化酶和溶解抗原混
合迅速加入SepHadexG- 25干粉3mg, 室温避光反应
3h;
稳定: 从SepHadexG- 25凝胶柱中洗脱偶联物,
每1mL接1管, 有颜色后0.5mL接1管。加临时配制的
NaBH4 液(用0.1mol /L NaOH配制成5mg/mL浓度)。
NaBH4液的用量应为洗脱物体积的1/20, 边加边搅拌,
30min后, 又加临时配制的NaBH4液(用量为反应体积
的1/10)。室温下反应继续搅拌反应1h;
分装, 于20℃下保存, 取少量进行质量鉴定。
1.2.3 包被抗体、酶标抗原最佳工作浓度的测定采
用方阵滴定法测定, 步骤如下: 包被抗体作系列稀
释(1:10000、1:15000、1:20000、1:25000、1:30000、
1:35000、1:40000), 每列一个稀释度, 加入各块酶标
板中, 100μL/孔。4℃过夜后洗涤, 加封闭液封闭。
酶标Btcry2Ab/2Ac杀虫蛋白作系列稀释(1:50、1:
100、1:150、1:200、1:250、1:300), 每行一个稀释
度, 50μL/孔。37℃温育1h后, 洗涤。
加入底物液显色后, 测吸光值。最后选择OD450
值在1.5的包被抗体和酶标Btcry2Ab/2Ac杀虫蛋白的稀
释倍数分别为其最佳工作浓度。
1.2.4 标准系列的配制和相关参数的计算将
Btcry2Ab/2Ac杀虫蛋白作系列稀释(0、20ng/mL、40ng/
mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、
2000ng/mL、4000ng/mL、8000ng/mL), 进行直接竞争
ELISA测定, 制备标准曲线。以Btcry2Ab/2Ac杀虫蛋
白添加量为零时的OD 值为B0, 各相应浓度的
Btcry2Ab/2Ac杀虫蛋白抑制时的OD值为B, 计算抑制
率I=(B0- B)/B0, 以抑制率为纵坐标, 以Btcry2Ab/2Ac
杀虫蛋白浓度的对数为横坐标作标准曲线, 并计算
回归曲线的方程与相关系数。根据标准曲线的分析
数据计算出检测限, 并确定检测范围。
1.2.5 样品提取样品(大豆、玉米等籽粒)用粉碎机磨成粉, 称取1g粉末加入样品提取液5mL, 混合匀浆
后4℃下静置1h, 然后4℃ 5000r/min离心20min, 吸取
上清液待测。
1.2.6 试剂盒的特异性、准确度、精密度和有效期
测定。
1.2.6.1 特异性试验用与Btcry1Ab、Btcry1Ac杀虫
蛋白的交叉反应率来表示。
1.2.6.2 准确度试验作3个水平(根据试剂盒的检测范
围确定加标浓度)6个重复的回收率试验, 回收率(%)=
(新样品测定值- 原样品测定值)/已知加标量×100。
1.2.6.3 精密度试验取6个浓度的标准溶液, 每个
浓度设6个重复, 分别在6d进行测定。
1.2.6.4 有效期测定对试剂盒稳定性采用37℃加速破坏试验进行研究: 取同一批次试剂盒分别放置于
4℃和37℃, 每隔24h进行ELISA测定, 将阴性对照和
阳性(即50%抑制率时B)的吸光值, 计算两者比值。当
B/B0<0.6个吸光或B/B0>0.7时, 即可判定ELISA试剂盒
已失效, 37℃下的24h相当于常温下的45d。
2 结果
2.1 包被抗体和酶标Btcry2Ab/2Ac杀虫蛋白的最佳工
作浓度的筛选
用系列稀释的包被抗体和酶标Btcry2Ab/2Ac杀虫
蛋白做方阵滴定, 选择OD值最接近1.5的浓度, 结果
见表1。
根据表1结果可以发现, 当OD450值接近1.5时, 包..........................
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