当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查
引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或
下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值
越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，
因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；
与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5 为好。
当然，在设计克隆目的的PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，
而且能值不会太低。这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹
结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的
GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游
引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基
因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测。这项检查
可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较
高，就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好，但对于特定的
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模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的
引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。
当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键弹出PCR 窗口，其中总结性地显示该引物的位
置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。
由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并
不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求
去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。
除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由Whitehead Institute
开发的“Primer 3”等（ 已引进并调试好该软件，欢迎使用）。该
软件的独特之处在于，对全基因组PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据
库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用。
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