基因组合生物合成新化合物——链霉菌质粒DNA提取

实验目的
组合生物合成是将不同化合物的生物合成基因重新组合后，形成新的生物合成途径，从而产生新的化合物，这是新药研究中的重要进展。目前许多具有生理活性的天然产物的生物合成途径已经研究清楚，利用组合生物合成技术通过改变聚酮合成酶的基因合成了一系列“非天然的”的聚酮类化合物库，以供进一步的活性筛选。本实验利用微生物中的聚酮体生物合成基因重组，产生新的化合物。

实验原理
    加利利链霉菌ATCC31671产生2-羟基阿克拉菌酮（2-hydroxyaklavinone）。将含有聚酮体酮基还原酶（polyketide ketoreductase，PKR）的质粒pWX03转入加利利链霉菌ATCC31671，可以产生阿克拉菌酮（aklavinone）。

  
                2-羟基阿克拉菌酮            阿克拉菌酮

图8-1  PKR的催化功能
实验材料和试剂
菌种：质粒pWX03（含PKR）/变铅青链霉菌（S. lividans TK18）。
溶液：1．溶菌酶溶液：0.3mol/L    蔗糖
                     25mmol/L   Tris-HCl（pH8.0）
                     25mmol/L   EDTA（pH8.0）
                      2mg/ml    溶菌酶
      2．碱性裂解液：0.3mol/L    NaOH
                      2%        SDS
      3．7.5mol/L NH4Ac溶液
      4．TE缓冲液：10mmol/L    Tris-HCl（pH8.0）
                     1mmol/L    EDTA（pH8.0）

实验步骤
    1．从含质粒pWX03的变铅青链霉菌（S. lividans TK18）斜面上挖块接种到20ml R2YE培养基（补加硫链丝菌素至作用浓度为25g/ml）中。28℃ 200r/min 培养48小时。
    2．取菌液1ml于eppendorf管中，3000r/min离心5分钟，收集菌体。
    3．将菌体悬浮于500l溶菌酶溶液中，37℃水浴中保温。每隔5分钟取一滴溶菌悬浮液于载玻片上，加入一滴碱性裂解液时，会变成透明粘稠为止。（如果发现不粘稠，则是DNA已经降解，最好用新鲜的菌丝重做。）
    4．加入250l碱性裂解液，迅速颠倒混匀，置65℃水浴中保温10～15分钟，取出在冰上放置3分钟。
    5．加入380l 7.5mol/L NH4Ac溶液，混匀，冰上放置10分钟。10,000 r/min离心10分钟。
6． 将上清液转移到二个新eppendorf管中，每管约500l。
7． 加入1000l无水乙醇，混匀，-20℃放置60分钟，沉淀DNA。
    8．10,000rpm离心10分钟，弃上清。干燥，沉淀溶于20l TE缓冲液中。合并二管DNA样品到一个管中。
8． 取10l DNA样品，琼脂糖凝胶电泳检查，具体操作方法见实验  水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 。