基因组合生物合成新化合物——基因重组

实验材料和试剂

    （一）实验材料

    加利利链霉菌（S．galilaeus）ATCC31671原生质体。

    质粒pWX03（Thio^R）

    （二）培养基和试剂

    1. YMA固体培养基（%）：用于加利利链霉菌斜面培养

       Malt extract                          1.0

       Yeast extract                         0.4

       葡萄糖                             0.4

       微量元素液                         0.2ml

       琼脂粉                             1.5

       pH 7.2

1.      GPS培养基（%）：加利利链霉菌发酵培养基

       葡萄糖                             2.25

       黄豆并粉                            1.0

       NaCl                                0.3

       CaCO₃                               0.3

       微量元素液                          2ml

1．硫链丝菌素（thiostrepton，Thio）

    （配制方法：用二甲基亚砜配制成50 mg/ml 的母液，备用。临用前取100ml母液加到10ml无菌水中，混匀，形成白色乳浊液，此时的浓度为0.5mg/ml）   

4. 25%PEG-1000溶液

（配制方法：称取2.5g  PEG-1000于一试管中，0.07Mpa高压灭菌30分钟。灭菌后加入7.5ml灭菌的P稳定液，加热融化即可）

    5．氯仿、甲醇、环己烷、乙酸乙酯。

    6．GF₂₅₄硅胶版

（三）器材  

 （四）仪器

    微量移液器、培养箱   

实验步骤

以下均需无菌操作

    （一）转化原生质体

    1. 取加利利链霉菌ATCC31671原生质体100ml于一个灭菌的eppendorf管中。

    2. 加入10 ml 质粒pWX03 DNA溶液到原生质体中，用手指轻弹管壁，使其混合。

    3. 加入400 ml含25% PEG1000溶液，用微量移液器上下吹吸几次以使其混合。

    4. 取此转化后的悬液100 ml，涂布于吹干的R₂YE平板上。

    5. 将平板28℃倒置培养20～24小时，肉眼观察可见的微小菌落。

    6．取1ml 0.5mg/ml的硫链丝菌素溶液，加到平板上，快速摇匀。待硫链丝菌素溶液全部渗入培养基中后，将平板28℃倒置培养120小时。

    （二）产物鉴定

    1．将长出的单菌落接种到含25mg/ml硫链丝菌素的YMA斜面上，28℃培养6～7天。

2．从YMA斜面上挖块接种到GPS培养基中，28℃振荡培养6天。

3．发酵液用氯仿：甲醇 = 9：1抽提，溶媒挥发浓缩后，将提取物溶于氯仿中。

4．在GF₂₅₄硅胶版上层析，溶媒系统为环己烷：乙酸乙酯 = 1：1。

5．层析完毕后，在365nm紫外灯下观察。记录产物的位置。

【提示】

    （一）影响转化的因素

    影响转化的因素有：制备原生质体时菌丝体的生长期，菌丝体和再生原生质体培养时的温度，转化时所用原生质体的数目，再生培养基平板的干燥程度，培养基的成份等。

    （二）实验操作中注意的问题

    1. 将原生质体和DNA充分混匀后，马上加入PEG是很重要的，如果原生质体和DNA混合的时间过长，从原生质体中释放出来的核酸酶可能破坏质粒DNA。

    2. 加入DNA溶液的体积不要过大，大于20ml溶有DNA的TE缓冲液可能导致原生质体的裂解。

【思考题】

1．本实验内容多，步骤复杂，分析那些因素是关系到实验成功与否的关键。