基因组合生物合成新化合物——原生质体制备

原生质体制备

实验原理

    菌体经溶菌酶处理后，去掉了细胞壁，露出球形且特别脆弱的原生质体，它对渗透压、振荡、离心等十分敏感。但由于原生质体结构与生理活性均未发生改变，故在适宜的条件下，可以再生出细胞壁进行细胞分裂。原生质体制备和再生的过程大致如下：

                        培养菌丝

                           ↓   

                        洗涤菌丝

                           ↓   

                     溶菌酶处理菌丝

                           ↓

                      形成原生质体

                           ↓

                          离心

                           ↓

                 用高渗溶液洗涤原生质体

                           ↓

                          过滤

                           ↓

                    显微计数原生质体

                           ↓

                      原生质体再生

    影响原生质体形成和再生的因素很多，如菌丝培养基的组成、溶菌酶的浓度、酶解的时间和温度等。不同的菌种对上述因素的反应也各不相同。

                             实验材料和试剂

    （一）实验材料

    加利利链霉菌（S．galilaeus）ATCC31671。

    （二）培养基和试剂

     1．R₂YE液体培养基（%）：用于加利利链霉菌菌丝培养

    （配制此培养基要求一种成分溶解后再加入另一种成分，不要全部称量完后再溶解）

       蔗糖                           10.3

       葡萄糖                          1.0

       蛋白胨                          0.4

       Yeast extract                      0.4

       Tryptone                         0.2

       Casamino acid                     0.1

       K₂SO₄                           0.025

       MgCl₂·6H₂O                      1.012

       微量元素溶液                      0.2ml 

       上述成分用50ml蒸馏水溶解后，加入下列溶液：

       0.5% KH₂PO₄                     1ml

       3.68% CaCl₂·2H₂O                 8ml

       0.25mol/L Tris-HCl（pH7.2）        10ml

       1N NaOH                        0.5 ml

       用蒸馏水定容至100ml，最终pH应在6.5左右。

      （分装：20ml/250ml三角瓶，每组4瓶。0.07Mpa高压灭菌30分钟）

    2. R₂YE固体培养基：用于加利利链霉菌原生质体再生

       R₂YE液体培养基加入1.5%的琼脂粉即可。

    3. 10%甘氨酸溶液  

    4. P稳定液

       蔗糖                             10.3g

       K₂SO₄                             0.025g

       MgCl₂·6H₂O                      0.2g

       微量元素溶液                      0.2ml

       用蒸馏水定容至80ml。

       上述溶液配好后，0.07Mpa高压灭菌30分钟。灭菌后加入下列无菌溶液：

       0.5% KH₂PO₄                        1ml

       3.68% CaCl₂·2H₂O                 10ml

       0.25mol/L Tris-HCl（pH7.2）         10ml

    5. 0.25mol/L Tris-HCl溶液

       （配制方法：称量三羟甲基氨基甲烷3.03克，用蒸馏水70ml溶解后，用浓盐酸调pH7.2，然后定容至100ml）

    6. 0.01% SDS溶液

       （配制方法：称量十二烷基磺酸钠0.01克，用100ml蒸馏水溶解即可）

    7. 微量元素溶液

       ZnCl₂                              0.04

       FeCl₃                              0.2

       CuCl₂·2H₂O                       0.01

       MnCl₂·4H₂O                       0.01

       Na₂B₄ O₇·10H₂O                   0.01

       (NH₄)₆ MO₇ O₂₄·4H₂O              0.01

       蒸馏水                          100ml

    8. 10mg/ml溶菌酶溶液

       称取100mg溶菌酶，溶于10ml P稳定液中，然后过滤除菌，备用。

    （三）器材

    （四）仪器

    微量移液器               离心机                  

    恒温水浴锅               摇床机               

    净化工作台               培养箱   

                             实验步骤

以下均需无菌操作

    （一）菌丝培养

    1. 从长好的斜面中部用接种铲取约1cm²大小，接种到20ml R₂YE液体培养基中，置摇床28℃振荡培养48小时。

    2. 48小时取下摇瓶，镜检无杂菌污染后，用5ml大口移液管吸取3ml菌液转入含有0.5%甘氨酸的R₂YE液体培养基中，继续置摇床28℃振荡培养20～24小时。

    （二）制备原生质体

     1．从摇床上取下菌丝培养液，吸取10ml菌液于50ml离心管中，3000r/min离心10分钟。弃去上清液。

    2．从摇床上取下菌丝培养液，吸取10ml菌液于50ml塑料离心管中，3000r/min离心10分钟，收集菌丝体。

    3．弃去上清液，打匀沉淀，加入10ml  P稳定液，3000r/min离心10分钟。

    4．重复步骤3一次。

    5．打匀洗涤后的菌丝沉淀，加入8ml P稳定液，再加入2ml 10mg/ml溶菌酶，使溶菌酶的作用浓度为2mg/ml。置37℃水浴中保温酶解。

    5．在整个酶解过程中，每隔5～10分钟轻轻振荡一次，以便促使原生质体从菌丝体上游离下来。

    6．酶解20分钟后，取样用压滴法制片进行镜检原生质体形成情况。当镜检绝大多数菌体脱去细胞壁，呈现单一的原生质体球时，停止酶解反应。

    7．用装有脱脂棉的过滤装置过滤。然后将滤液转入50ml塑料离心管中。

    8．3000r/min离心7分钟，小心弃去上清液。用手指不断轻弹离心管壁，直至原生质体分散在残留的液体中，形成奶状悬液。

    9．加入10ml  P稳定液，悬浮原生质体。

   10．重复步骤8和步骤9一次，洗涤原生质体。

   11．取一滴原生质体悬液于血球计数板上，在显微镜下准确计数，得到原生质体总数。

    （三）原生质体再生

    1．取原生质体悬液用P稳定液连续稀释到10^-6，然后分别取10^-4、10^-5、10^-6稀释液各0.1ml，分别加在固体R₂YE平板上，用三角爬涂匀，28℃倒置培养5天，取出统计原生质体再生菌落数。

    2．取1ml原生质体原液，加入9ml 0.01%SDS溶液。28℃培养1小时，然后取0.1ml加在固体R₂YE平板上，用三角爬涂匀，28℃倒置培养5天，取出统计非原生质体再生菌落数。

              原生质体再生菌落数 - 非原生质体再生菌落数               

    再生率 =                                             ×100%

                            原生质体总数              

【提示】

    （一）实验中注意的观察的现象

    1．在整个酶解过程中，注意观察酶解溶液有什么变化。

    2．原生质体的形态。

    （二）实验操作中注意的问题

    1．步骤8必须用手指不断轻弹离心管壁，直至原生质体分散在残留的液体中，形成奶状悬液，否则原生质体沉淀很难分散开。

    2．涂布原生质体时，要避免反复来回涂布，因为原生质体细胞没有细胞壁，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响再生率