农学院 生物技术专业 唐杰
(指导教师:刘永建副教授 李平教授)
摘要:本研究采用的Rpp39是从四川生态条件下分离的一株苏云金芽孢杆菌,经形态,
生理生化测定,该菌为苏云金芽孢杆菌杀虫变种(Bacillus thuringiensis var entomocidus).
生物测定结果表明,该菌对菜青虫(Pieris rapae L.)具有很高的毒杀作用.根据Genebank
中的cry基因序列设计了几对引物,对该菌所含有的cry基因型进行了初步鉴定.结果表
明,该菌不仅含有对鳞翅目(Lepidoptera)高毒力的cry1类中的cry1Aa,cry1Ab和cry1Ac
基因,还含有对双翅目(Diptera)高毒力的cry2类基因,对鞘翅目(Coleoptera)高毒力
的cry3类基因以及对线虫(Pratylenchus spp.)有活性的cry5类基因.
关键词:苏云金芽孢杆菌,杀虫晶体蛋白基因,PCR
Screening, Identification of One Novel Bt Strain Rpp39 and
Analysis of Its cry-type Gene
By Tang Jie,Major in biotechnique in college of agriculture
Directed by associate prof. Liu Yongjian and prof. Li Ping
Abstract: Strain Rpp39 in the research is a strain of Bacillus thuringiensis isolated from
Sichuan ecosystem. According to the identification of modal, physiological and biochemical
characters, this strain belongs to Bacillus thuringiensis var entomocidus. Bioassay showed that
this strain appeared high insecticidal activity against Pieris rapae L. Primers were then designed
to identify the genotype of cry genes. The results indicated that this strain contains cry1Aa,
cry1Ac,cry1Ab genes highly toxic to Lepidoptera and cry2 gene highly toxic to Diptera and
cry3 gene highly toxic to Coleoptera and cry5 genes highly toxic to Pratylenchus spp..
Key words:Bacillus thurigiensis, Insecticidal crystal proteins gene, PCR
1文献综述
1.1 苏云金芽孢杆菌的一般特性
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌.
它是一种微生物杀虫剂,在形成芽孢的同时能够产生由一种或几种杀虫晶体蛋白
(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)组成的伴孢晶体[1-3].Bt的杀虫活性与其携带的编码ICP
2
的cry基因密切相关,Bt已作为最为有效的微生物杀虫剂广泛用于害虫的生物防治[4].
苏云金芽孢杆菌对人,畜及害虫天敌极少或完全没有毒害作用,不污染环境,保持生
态平衡,在农业,林业,卫生害虫的生物防治中占有重要地位.它最早发现于家蚕的猝倒
病,1909年,Berliner从德国苏云金省(Turingien)的一个面粉厂寄出的一批染病地中海
粉螟中分离到一种杆菌,1915年4月他详细描述了该菌的形态和培养特征,并将其定名为
苏云金芽孢杆菌[5].
自从发现苏云金芽孢杆菌以色列亚种(B.thuringiensis subsp.israelensis)对双翅目有活
性以来[6],现已发现它对鳞翅目,双翅目,鞘翅目以及膜翅目,同翅目等翅目等昆虫都有
杀虫活性,同时对螨类,线形动物门中的动植物寄生线虫,原生动物门中的鞭毛虫,变形
虫和草履虫及扁形动物门中的扁虫,吸虫,绦虫等都显示出毒杀活性.目前,苏云金芽孢
杆菌已成为世界上应用最广泛的生物杀虫剂,受到世界各地学者的极大关注.
1.2 苏云金芽孢杆菌的分子生物学特性
1.2.1 杀虫晶体蛋白基因类型
正当Gonzalez等利用质粒消除法研究质粒与晶体蛋白基因的关系时[7],1981年Schnepf
和Whiteley从库斯塔克亚种HD-1中克隆到杀虫晶体蛋白的第一个基因[8],紧接着Klier
等从苏云金亚种Berliner1715中克隆到2个杀虫晶体蛋白基因,并将其中之一在大肠杆菌
中表达[9].由于苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因具有多样性,因此如何将它归类的问题受到
了世界各地学者的关注.1989年Hofte和Whiteley根据晶体蛋白氨基酸序列的同源性和杀
虫谱的差异,将已序列化的42个基因分为5类14个亚类[10].其中具有溶血溶细胞作用的
27kD晶体蛋白基因命名为cyt基因,其它只有杀虫活性的13亚类命名为狭义的晶体蛋白
基因,即cry基因.cry基因可划分为四群,即cryⅠ为鳞翅目特异性,cryⅡ为鳞翅目和双
翅目特异性,cryⅢ为鞘翅目特异性,cryⅣ为双翅目特异性.该分类系统被广泛采用后,
新发现的基因不断按其原则列入该分类系统,如cryⅠF,cryⅡC, cryⅡB和cytB等,到
1992年,该系统增至7类29亚类[11].但随着新基因的不断发现,有些基因的分类地位难
以确定.如cryⅠG的杀虫谱与cryⅠ相似,但其序列却有很大差别.鉴于此,在1995年
无脊椎动物病理学(SIP)年会上成立的cry基因命名委员会,提出新的分类系统,其与上
述HW系统的主要区别在于各基因的鉴定只根据晶体蛋白的氨基酸序列的同源性的差异,
即氨基酸序列相似性45%,75%和95%,将已知的94种基因分为4个等级,共17群36
个亚群52类94个亚类基因,到1997年增至21群44亚群64类116亚类基因.根据Crickmore
等(1998)建立的因特网增补资料表明,截止2001年5月6号,共列出34群(其中cry基
3
因32群,cyt基因2群)60类97亚类218个基因,,并采用了阿拉伯字母代替原来的罗马
字母进行编号.其中第1群是最大的类群共11类36亚类113个基因[3,12].
1.2.2杀虫晶体蛋白基因在苏云金芽孢杆菌的分布
苏云金芽孢杆菌已发现218个基因,表明它具有丰富的杀虫晶体蛋白基因,并可预计
随着新菌株的分离和研究的深入,我们将发现更多的基因.这些基因分布在苏云金芽孢杆
菌不同菌株中,不同血清型,不同亚种之间,而且杀虫晶体蛋白基因数及种类也存在明显
差异,甚至不同来源的同一亚种苏云金芽孢杆菌其基因型也存在差异,如库斯塔克亚种菌
株HD-1,NRD-12,HD-263,HD-73基因数分别1-5个不等.在研究的过程中,发现苏云
金杆菌形成伴胞晶体的能力很容易丢失,而且不能回复,呈现与质粒编码的特征相似.
Gonzalez通过质粒消除,接合转移的方法证明大多数晶体蛋白基因定位于较大且可转移的
质粒上[7];1983年,Kronstad等通过分子杂交的方法,进一步证实了苏云金芽孢杆菌的大
多数伴胞晶体基因定位于质粒上[13],与质粒消除和接合转移的结果吻合.研究发现,这些
晶体蛋白基因并不是随机分布于这些大质粒上,而是仅定位于少数一些质粒上,这些质粒
都大于35MD,拷贝数往往很低.在苏云金芽孢杆菌的野生型菌株中,通常每个细胞具有
多个带有cry基因的质粒,而有些质粒又带有一个到几个晶体蛋白基因,特别是cry1,cry4
和cry11基因,这些复合的cry基因可以直接合成特殊的蛋白质,进而形成形态明显不同
的晶体.即使分布于同一菌株的杀虫晶体蛋白基因,也可能定位于不同的质粒上,如库斯
塔克亚种菌株HD-1中,cry1Ab基因定位于44MD上,其它的定位于110MD上;而有的
菌株多基因定位于同一质粒上,如以色列亚种HD-367菌株中的五个杀虫晶体蛋白基因都
定位于75MD;甚至有的杀虫晶体蛋白基因定位于染色体上,如武汉亚种cry1Aa基因,加
拿大亚种HD-224等菌株中的一些晶体蛋白基因都定位于染色体上[13].
1.2.3 杀虫晶体蛋白基因的结构
苏云金芽孢杆菌晶体蛋白基因ORF两端内外具有明显的表达结构,如启动子,核糖体
结合位点(RBS)和终止子.但有的基因上游附近没有启动子,而是作为操纵子中的一部
分,如cry2Aa基因,或有一个起终止子作用的茎环结构,如kurstaki HD-1毒素基因的DNA
序列[14].更有意义的是, 在编码晶体蛋白的起始密码子附近有一些相同正向重复序列和
反向重复序列,在基因cry1Ac下游有两个连续的反向重复序列,而且紧接着后一个重复序
列有一个poly(T)结构,这些结构是明显的转录终止子;在cry1Ac中存在3个正向重复
序列,这些结构有可能使5ˊ和3ˊ的非翻译区得以校正.基因cry1Aa和cry1Ac的mRNA
的5ˊ和3ˊ具有较长非编码区,5ˊ末端有80-90bp,3ˊ末端有约110bp;而且在终止密码子
4
之前有一个RBS结构,其后不远有一个起始密码子,四个有义密码子和一个终止密码子,
这些结构可以起增强基因表达的作用[15-18].
1.2.4 杀虫晶体蛋白基因的克隆
1981年Schnepf从菌株HD-1Dipel中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因[8],并用转
座子Tn5确定了结构基因所在位置, 1989年将该基因命名为cry1A(a),在新的命名系
统中为cry1Aa1.由于可用第一个克隆的基因做探针,大量杀鳞翅目幼虫特异性晶体蛋白
基因被克隆并被序列分析.对双翅目有杀虫活性的基因主要来自以色列亚种和莫里逊亚
种,Ward等首先克隆了cyt1A基因,并发表了其特征和序列.Walwijk等用体外转化-转录
系统检测转化子表达的方法克隆到基因cyt1A,并测出了核苷酸序列.日本京都大学测定
了12株以色列亚种的杀虫活性,并与库斯塔克亚种和球形芽孢杆菌进行了比较,还对以
色列亚种的两种130kDa杀虫蛋白基因进行了克隆和测序.Krieg等首次分离到对鞘翅目昆
虫有毒性的拟步行甲亚种,1987年三个实验室同时分离了相同杀鞘翅目昆虫的cryⅢA(即
cry3A)基因,1990年以后又报道了其他对鞘翅目有毒的基因.近年来发现了一些新的杀
虫活性菌株,如一些菌株对同翅目,膜翅目和蜱螨目,以及线形动物门,扁形动物门和原
生动物门有杀虫活性,随着研究的不断深入,这些新的杀虫活性蛋白基因也正在被克隆[19].
1.2.5 PCR技术在苏云金芽孢杆菌ICP基因鉴定中的应用
苏云金芽孢杆菌ICP是单基因直接表达的产物,不同基因型所表达的产物具有显著不
同的杀虫特异性.因此,弄清ICP基因型,对于菌株鉴定及筛选,杀虫特性的了解,杀虫
谱的改良等,都具有重要意义.90年代以来,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,
PCR)技术以其快速,简便,灵敏的特点在Bt菌ICP基因的鉴定上得到了广泛应用,新的
δ-内毒素基因不断被分离,克隆[20].
1.3 苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白的基因工程进展
自本世纪分离到第一株苏云金芽孢杆菌以来,在世界范围内每年都分离鉴定出新的Bt
菌株,其中一些高效广谱的菌株已被运用到生产中.但是,近几十年来的研究发现,这些
天然菌株无论在杀虫特异性,杀虫毒力及持效期方面仍不能满足实际生产的需要.随着对
苏云金芽孢杆菌分子生物学和分子遗传学的深入研究,构建具有优良性能的重组菌株成为
国内外微生物农药发展的一个方向.
在自然状态下,苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因自发转移的频率是很低的,因此要实现
这些基因的转移和重组,通常需要采用一些特定的技术手段,包括:质粒的接合转移,转
化,转导,位点特异性重组以及原生质体融合.目前,已有不少将Bt杀虫晶体蛋白基因转
5
入不同微生物的报道, Karamata等以库斯塔克亚种HD-73菌株和拟步行甲亚种菌株为亲
本进行接合转移[21],发现部分接合子除对粉蚊夜蛾和辣根猿叶甲有毒性外,还对海灰翅夜
蛾有毒,Crickmore[22]等也观察到了这一现象.在国内,中国科学院植保所将分离的cry3Aa
导入携带有cry1Ba的Bt野生菌株UV-17中,构建了一个高毒力广谱工程菌株[23],该菌株
既对鳞翅目小菜蛾幼虫具有高毒力,同时对鞘翅目叶甲类害虫幼虫具高毒力.杀虫晶体蛋
白的表达量是影响工程菌杀虫毒力大小的重要因素,研究表明,cry1,cry2和cry11类基
因是依赖于芽孢形成的ICP基因,它们的表达受到芽孢形成过程的调控.但是Malver等发
现,Cry3A蛋白在无芽孢的EG1351菌株中的产生量是野生菌株的2.5倍,通过质粒消除,
增加ICPs基因拷贝数和稳定数等途径使菌株的毒力得以提高,这是工程菌构建的一种新思
路.荧光假单孢杆菌野生菌株P303对小麦全蚀病菌具有良好的抑菌活性和较强的根部定
殖能力.1995年,张光焰等以广寄主质粒pUC18/pUC19为载体,用电激转化法将Btcry1Ac
基因片段导入了荧光假单胞菌P303菌株,并获得表达,从而得到转Bt ICP基因的荧光假
单胞菌工程菌PT410和PT415[24].该工程菌株不仅保持了野生型菌株对全蚀病的抑菌活性,
同时还表现出对玉米螟和小菜蛾的杀虫活性,因而具有杀虫和防病双重功能.
生物杀虫剂使用的常规方法是通过空间和地面的喷撒杀伤害虫.许多生态因素的变
化,如阳光,温度,降雨等使Bt杀虫剂的性能很不稳定.转基因植物的产生为提高苏云金
杀虫剂的效果开辟了新的途径.自1987年首次获得转cry1A基因以来,全世界有许多实
验室和公司先后将不同株系的不同Bt基因转入多种作物,如烟草,棉花,水稻,蕃茄,小
麦,玉米,苹果,核桃,土豆,白云杉等许多植物中,其中一些转基因植物已通过了大田
实验.1991年范云六等将Bt杀虫毒素基因通过植物表达载体导入我国棉花品种和水稻品
种而表达成功.1995年赵荣敏,范云六等将人工改造的Bt基因与CPTi基因共转化烟草,
获得含双基因的高抗虫转基因烟草,表现出比转单基因烟草有更高活性的杀虫活性,这些
转基因植物对于延缓害虫对晶体毒素产生抗性的研究具有重要意义[23].近年来,出现了越
来越多的转基因植物,转Bt基因的研究也受到各地学者的重视,国内外的生物工程热将把
转基因植物的研究推向高潮.
最近几十年的统计显示[25],农作物的病虫害给农业带来了具大的损失.虽然采用化学
农药防病抗虫取得了不错的效果,但却产生很多负面的影响[26].因此,优点众多的生物农
药登上历史的舞台,而目前使用最广泛的生物农药是苏金芽孢杆菌杀虫剂[27].但是随着
Bt制剂应用的不断扩大,cry基因编码产生的晶体蛋白均在不同程度上引发了昆虫抗性
6
[28,29],为避免抗性昆虫所造成的损失,寻找新的高毒力菌株是解决这个问题的有效途径.
对Bt菌株的cry基因型进行鉴定,可以预测其杀虫活性,为分离克隆新的cry基因提供重
要的基因来源.
本试验中的Rpp39是从四川生态条件下分离的一株苏云金芽孢杆菌,这为新型杀虫基
因克隆及转基因抗虫育种,新型杀虫工程菌株的构建和苏云金芽孢杆菌制剂的开发与应用
打下基础.通过试验发现,该菌株对农业害虫菜青虫具有较强的毒杀作用.经形态,生理
生化测定,该菌为苏云金芽孢杆菌杀虫变种(Bacillus thuringiensis var entomocidus).根据
GeneBank中公布的cry基因序列设计了几对引物,对该菌的杀虫晶体蛋白基因进行了初步
的分析,为进一步研究该菌,克隆新的杀虫晶体蛋白基因鉴定了基础.
2 材料与方法
2.1材料与培养基
2.1.1供试菌株 从四川温江土壤中筛选的野生型苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
菌株.
2.1.2 供试昆虫:菜青虫
2.1.3培养基
醋酸钠培养基(1000ml) 牛肉膏 5g + 蛋白胨10g + 醋酸钠34g pH 7.0
LB培养基(1000ml) 胰蛋白胨10g + 酵母粉5g + NaCl 10g pH 7.0
牛肉膏蛋白胨培养基(1000ml) 牛肉膏5g + 蛋白胨10g + NaCl 5g + 琼脂17-20g pH
7.0
卵黄琼脂培养基(1000ml) 肉浸液1000mL + 蛋白胨15g + NaCl 5g + 琼脂25-30g +
50%葡萄糖水溶液 + 50%卵黄盐水悬液 pH7.5
葡萄糖斜面琼脂培养基(1000ml) 葡萄糖20g + 琼脂20 g + KH2PO4 1 g + MgSO4 1 g
+ 蛋白胨1 g + 牛肉膏0.5 g + 水1000ml pH 7.0
2.2实验方法
2.2.1菌株的分离
2.2.1.1 土样采集方法
未施用过Bt菌剂的耕作土,菜园土,荒土,草地土及干鲜作物,果品,蔬菜及粮食的
储藏地点的土壤和尘土等均为采集对象.先将表层土铲去约1-2cm,再称取约50g,每采
样点至少取5处,所采土样装入无菌袋内备用.
7
2.2.1.2 醋酸钠-抗生素法[30,31]分离菌株
称取10g土样放入装有50ml醋酸钠培养基(牛肉膏5g,蛋白胨10g,醋酸钠34g,蒸
馏水1000ml,PH7.0)的摇瓶中,分别加入青霉素钠盐和硫酸庆大霉素各400ug/ml,摇床
培养(200r/min,30℃)4小时.培养结束后取土壤悬液10ml,加入无菌的离心管内3000r/min
离心15分钟,取上层混浊液2ml于65℃水浴15分钟,取热处理后的混浊液0.1ml涂平板
(牛肉膏蛋白胨培养基),将平板置30℃培养箱中培养,48小时后从平板上挑取类似Bt
的菌落涂片.
2.2.2菌种鉴定
2.2.2.1 菌体形态特征
待测菌株于牛肉浸汁琼脂,LB琼脂培养基上好氧培养,30℃培养2-4d后用电子显微
镜及光学显微镜进行常规的菌体形态观察并照相.
革兰氏染色[33]:挑取少许经18-24h培养的E.coli,待测菌株分别作涂片,风干,火
焰固定,滴加结晶紫混合液初染约 1min,再滴加碘液媒染约 1min,水洗,吸干.用 95%
乙醇或丙酮脱色,流滴至洗脱液无色(约 30s).用番红染液染 2-3min,水洗,风干.深
紫色为革兰氏染色阳性细菌,红色为革兰氏染色阴性细菌.
石炭酸复红染色[33]:按常规方法制成涂片,滴石炭酸复红染液染1min,然后风干,镜
检.观察有无伴胞晶体,有伴胞晶体者测量菌体,芽孢及晶体的大小.
芽孢染色[33]:取培养72h左右的待测菌株涂片,干燥,固定,用饱和的孔雀绿水溶液
(约为7.6%)染10min.用木夹夹住载玻片在火焰上加热,使染液冒蒸汽但勿沸腾,不要
使染液蒸干,必要时加入少许染液.加热时间从染液冒蒸气时开始计算,共4-5 min.倾去
染液,待玻片冷却后洗至孔雀绿不再褪色为止.用番红水溶液复染1min,水洗,待干燥后
置于油镜下观察,芽孢呈绿色,菌体呈红色.
鞭毛染色[33]:在载玻片的一端滴一滴蒸馏水,用接种环挑取在斜面上生长的少许菌苔,
在载玻片的水滴中轻沾几下,将玻片倾斜,使菌液缓慢流到另一端,然后平放在空气中干
燥.涂片干燥后,滴加染色A液染10min,用蒸馏水冲洗,干燥或将残水沥干或用乙醇冲
去残水后,加染色B液染30-60s,加热,使其冒蒸汽而染液不干,冷却后用蒸馏水冲洗,
镜检时菌体为深褐色,鞭毛为褐色.
抗酸染色[33]:按常规方法涂片,滴加石炭酸复红于载玻片上缓缓加热,使染液冒蒸汽
但不沸腾,并继续滴加染液,不使涂片上染液蒸干,这样保持5min;涂片冷却后,倾去染
液,用酸性乙醇脱色到无红色染液洗脱为止,彻底水洗;用吕氏美蓝复染2-3min;水洗,
8
吸干,镜检.抗酸性细菌菌体呈红色,非抗酸性细菌呈蓝色.
2.2.2.2 培养特征
在LB琼脂,营养琼脂,牛肉浸汁琼脂,葡萄糖斜面琼脂和卵黄琼脂上30℃培养2-4d
后观察菌落形状及菌体颜色等.
2.2.2.3细胞壁化学组分分析
按照Hasegawa.T等的快速薄板层析法(Thin layer chromatograph.TLC)进行全细胞水解
液氨基酸及糖型分析.
2.2.2.4生理生化特征
参照《Bergeys Manual of Systematic Bacteriology》V01.II的内容对菌株进行生理生化
鉴定[32].
2.2.3 PCR法鉴定Bt菌cry基因类型
2.2.3.1菌株培养和预处理
挑取活化菌株的单菌落于LB液体培养基,30℃,200r/min培养过夜,收集菌体,采
用硅胶膜型TM基因组DNA提取试剂盒提取其总DNA.
2.2.3.2 PCR引物
根据GeneBank中公布的cry基因序列,采用Primer premier及Oligo软件设计了cry1
类基因的特异引物以及cry2,cry3和cry5类基因的通用引物(见表1).
表1 特异引物和通用引物的特性
Table 1. Characteristics of general and specific primers.
引物对
Primer
pair
引 物 序 列
Primer sequences
产 物 长 度
Product size (bp)
退火温度
Annealing
temp(°C)
Spe-1Aa 5'TGCATAGAGGCTTTAAT-3
5'-CAGGATTCCATTCAAGG-3'
1500 %50
Spe-1Ab 5'-CGCTAACGCAATTTCTTTTGAGTG-3'
5'-GAGCCAAGATTAGTAGATTTTGTTAA-3'
858 )50
Spe-1Ac 15'-ATCACTGAGTCGGTTCGCATGTTTGACTTTATC-3'
5'-TCACTTCCCATCGACATCTACC-3'
517 465
Spe-1C 65'-CCACAGTTACACTCTGTAGCTC-3'
5'-CACTTAATCCTGTGACGCCT-3'
780 954
Gen-2 A5'-CAGATACCCTTGCTCGTGTAATGTTTGACTTTCTC-3'
5'-ATAGGCCCGGTGCTCCACCAGG-3'
540 D65
Gen-3 F5'TTAACCGTTTTCGCAGAGA3'
5'TCCGCACTTCTATGTGTCCAAG3'
733 I52
Gen-5 Q5'-ATGAAACTAAAGAATCAAGA -3'
5'-ACCTGTGCTATACAATTTCA-3'
726 T49
2.2.3.3 PCR反应体系
10×buffer 2.5μl
MgCl2(25mM) 1.5μl
Taq酶 0.2μl
dNTPs(2.5mM) 2μl
引物 2μl
模板 5μl
最终反应体积 25μl
2.2.3.4 热循环反应
94℃预变性5min;94℃变性1min,退火温度根据引物而定,72℃延伸2min,30个循
环;72℃延伸5min;4℃停止反应.扩增反应产物在1%琼脂糖凝胶上电泳,置凝胶成像系
统中观察PCR扩增结果.
2.2.4菌株Rpp39室内杀虫毒力测定
2.2.4.1试验处理和方法
在LB固体培养基上挑取菌株的单菌落接种于LB 液体培养基中,30℃,200r/min 振
荡培养72 h,再将菌悬液稀释到0.5亿/ml的孢晶混合液,将大小一致的新鲜甘蓝叶片(及
水稻秸杆)浸入待测液中,浸泡5min后取出自然晾干,即得处理一Rpp39.设用不含任何
其他物质的LB液体培养基浸泡的叶片为对照,即处理二CK.分别用Rpp39和CK饲喂菜
青虫,每处理30头幼虫(2-3龄),分别于1,2,3d后调查幼虫死亡情况.
2.2.4.2试验数据分析
根据菜青虫幼虫死亡情况,计算其死亡率,死亡率(%)= 菜青虫幼虫死亡头数 / 菜
青虫幼虫总头数;并计算其校正死亡率,校正死亡率(%)=(试验组菜青虫幼虫死亡率
-对照组菜青虫幼虫死亡率)/(100-对照组菜青虫幼虫死亡率).
所有菜青虫幼虫死亡率数据先进行反正弦平方根转换sin1 x,然后对转换后的数据配
对设计,进行t检验,测验Rpp39和CK的杀虫毒力的差异显著性.所有数据分析均在
Excel2003中进行.
3 结果与分析
3.1菌株鉴定结果
3.1.1形态特征
9
ü: K0'+$ K0 Rpp399 ,X9 O4 6 ( ,¨6^ 6^
K 0^× m× m¨E ) ^ ^ -`J f × 9 O4 6
6$ ¨! 6$ Y 8 6¨*ó¨J 6J'¨6$ +97| ×
9 O4 6 > m× m~~ 1' 2 ~9 M=D! §8FL ¨kGL§8FL ~
1 Rpp399 ,X6J'^8 6 9 O4 6 (2500×) 2 Rpp399 ,X9 O4 6 / +c,XM ! (15000×)
Fig 1 parasporal crystal, spore and nutritional Fig 2 nutritional cells and thin flagella of
Cell of Rpp39 strain(2500×) Rpp39 strain(15000×)
3.1.24 6 :4 d
Rpp399 ,X<3~
10
11
表3 Rpp39菌株的生理生化特征
Table 3. Physiological and biochemical characters 0f the strain Rpp39.
特 征
Characters
结 果
Results
特 征
Characters
结 果
Results
V-P 测试 - 形成卵磷脂 -
接触酶反应 + 水杨苷分解 -
淀粉水解 + 膜的形成 +
明胶液化 + 尿酸酶反应 -
乳脂凝固 - 葡萄糖利用 +
乳脂聚合 - L-阿拉伯糖利用 -
七叶苷水解 + D-木糖利用 -
柠檬素利用 + D-甘露糖利用 +
硝酸盐还原 - D-蔗糖利用 +
形成吲哚 - 纤维二糖利用 +
水解蛋白 + R
注:"+"阳性反应;"-"阴性反应.
3.1.5菌种鉴定结果
根据形态与细胞壁化学组分相结合定属的原则,Rpp39菌株革兰氏染色阳性,不抗酸,
产生芽孢;细胞壁化学组分II型,属于芽孢杆菌属(Bacillus);且菌株呈现较短的菱形,
属于苏云金芽孢杆菌群;结合培养特征和生理生化特征定种的原则,该菌株的菌落微黄白
色,乳白色,表面较平滑,无可溶性色素产生;V-P反应,水杨苷分解阴性,接触酶反应,
淀粉水解,七叶苷水解以及蛋白水解阳性,不产生卵磷脂酶和脲酶,形成薄的菌膜,利用
纤维二糖,甘露糖,葡萄糖等生长.这些特征均与血清型H6的菌种生理生化特征基本相
似,且苏云金杆芽孢菌杀虫变种血清型为H6,所以Rpp39菌株定名为苏云金芽孢杆菌杀
虫变种(Bacillus thuringiensis var. entomocidus).
3.2菌株Rpp39的杀虫晶体蛋白基因分析
用设计的引物对Rpp39菌株进行PCR反应,结果表明,此菌株除含有cry1类中的
cry1Aa,cry1Ab,cry1Ac基因外,还含有cry2,cry3和cry5这三种基因型,而不含有cry1C
基因(见图3).说明该菌株不仅含有不同的基因型,还含有同一基因类型中的不同基因亚
型.由此可推测菌株Rpp39的杀虫活性不是由一种cry基因决定的,而是由多种cry基因
协同作用的结果.
M Marker 1 CK
2 cry5 3 cry3
4 cry2 5 cry1C;
6 cry1Ac 7 cry1Ab;
8 cry1Aa.
3 Rpp399 cry ·HHn4§p
Fig 3 PCR products amplified from strain Rpp39 with primers
3.39 Rpp39xY< ! o#n
üH rP'E / ¨9°M& "N G \
¨A¨ F… P< üó§Bt9 # N ! E ~ó§9 # 1 ¨P |E 4 ¨ h
&I¨P "ˇ) B5¨J T e ) b'6 '{~!O < 'KS¨6t T ¨' H
#\ F' T ¨7$& ( × H < 'T 8F¨7$& ¨ 7`~5à ';oA'<) N G EW ¨
f EW ¨< #C ¨ 6 !7(V 4)~
Rpp39 CK
4 ó§Rpp39,X9°M&< 'CK
Fig 4 Pieris rapae L infected by strain Rpp39 and CK
ü25-30,XxY5 ¨OFVRpp39¨24h 9°M&< P< G !Ou¨!Ou)[E'
74.41%¨48h !Ou)[4 4`rP ¨rt18.45%~72h E'Z!OuP ~¨!Ou)[rt7.65%¨
E'100%×5àOFVCK¨9°M&< P< !Ou)[\ ¨ AEà,X K¨!Ou)[ 3AE ( 5)~
) K¨K
9°M&< !Ou)[
5SS
&.
5 ) K¨ 9°M&< !Ou)[,XG2ˇ
Fig 5 The relation between mortality of Pieris rapae L and time of treatments
12
由表4可以看出Rpp39对菜青虫有较高的毒杀作用,它们之间在杀虫毒力方面有显著
差异.这说明菜青虫是菌株Rpp39的敏感昆虫,采用Bt制剂是防治菜青虫的理想生物农
药.
表4 菌株Rpp39的生物测定结果
Table 4. Bioassay results of strain Rpp39
处 理
Treatment
处 理 时 间(h)
Time of treatment
死 亡 率(M)
Mortality (%)
平均死亡率(M)
Average mortality(%)
校 正 死 亡 率(CM)
Corrected mortality (%)
24h 74.41 77.83
48h 92.86 92.35
Rpp39
72h $100
89.09 a*
100
24h )3.33 -
48h 26.67 -
CK
72h 610
6.67 b
-
注:* 表示两处理差异显著性
4 讨 论
菌株Rpp39分离自四川生态条件,属于苏云金芽孢杆菌杀虫变种(Bacillus
thuringiensisvar entomocidus),进一步丰富了我国Bt资源,同时为研制新型高效微生物杀
虫剂提供了丰富的菌种资源.
PCR是一种检测目标DNA序列最为有效和快速的方法[34],已经被许多学者用于鉴定
Bt的伴孢晶体蛋白基因组成和预测它们的杀虫活性[35-38],但PCR本身也存在诸如低拷贝
杀虫基因被忽略,沉默的杀虫基因干扰杀虫活性的预测等缺陷,特别是为寻找对靶虫更有
效或结合靶虫不同受体的毒蛋白时,无法提供直接信息.因此,更好的鉴定杀虫晶体蛋白
基因的方法有待于我们去挖掘.本研究应用PCR 技术检测到Rpp39菌株含有多种复合的
高效基因cry1Aa,cry1Ab,cry1Ac,cry2,cry3以及cry5,对重要的农业害虫菜青虫具有
较高毒杀作用,说明四川生态条件下的Bt资源有其自身的特点.由于采用的引物有限,所
以不能对Bt菌所含的全部基因型进行鉴定,是否还含有其它类的cry基因,还有待于进一
步研究.
Rpp39菌株在室内有很高的杀虫活性,而在室外该菌株依然有很高的杀虫活性[39],但
是,室外杀虫效果受很多因素的影响,如同种昆虫不同虫期对苏云金芽孢杆菌的敏感性不
同,不同昆虫对苏云金芽孢杆菌的敏感性不同,还有温度,湿度等诸多环境因素.因此,
还需要更周密,更详尽的试验来检测该菌株的室外杀虫活性.Rpp39菌株具有这么高的杀
虫活性,可能与它含有多种复合的高效cry基因有关.有研究表明由多种cry蛋白构成的
13
14
晶体往往比单一蛋白晶体有更高的杀虫毒力[40,41],特别是cry5的作用有助于延缓抑制昆虫
抗性的产生[42].所以,菌株Rpp39在杀虫的广谱性及延缓抗性方面很有特色,因此,通过
特定的技术手段,如选择性质粒改造,接合构建新菌株等,可以将其开发成工程菌,扩大
其杀虫谱,提高杀虫效果,延长持效期.
生物杀虫剂有很多优点,但其使用效果受很多因素的影响,如阳光,温度,降雨等,
从而使Bt杀虫剂的性能很不稳定.转基因植物的产生为提高生物杀虫剂的效果开辟了新的
途径.不少的例子[23,27,43,44]已经证明转基因植物有很好的杀虫活性,这些转基因植物对于
延缓害虫对晶体毒素产生抗性的研究具有重要意义.近年来,出现了越来越多的转基因植
物,转Bt基因的研究也受到各地学者的重视,国内外的生物工程热将把转基因植物的研究
推向高潮.
由于时间,季节等诸多方面因素的影响,本研究还有一些未完善的地方.例如,本研
究只鉴定了菌株基因杀虫晶体蛋白的类型,而未进行杀虫晶体蛋白的分离,杀虫晶体蛋白
基因的克隆,序列分析及定位等等.因此,我对后续研究进行了如下的设想:1 扩大筛选
源,发掘大量的新型Bt杀虫资源.2 优化筛选Bt菌的方法.3 寻找更好的鉴定cry基因
类型的方法.4 对Bt的cry基因进行克隆.5 对Bt菌的促生机制进行研究.6 构建防病,
抗虫的工程菌株.7 对克隆出的cry基因进行改造,为转基因打下基础.8 苏云金芽孢杆
菌菌剂的研究及产业化研究.
主 要 参 考 文 献
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致 谢
我衷心的感谢我的导师刘永建副教授和李平教授,以及郑爱萍副教授,谭芙蓉师姐,郑秀丽师姐
和周华强师兄!因为从论文选题到撰写的过程中,我一直得到了你们的悉心指导和帮助.正是有了他们
的严谨细致,一丝不苟的工作作风以及试验过程中循循善诱的教导和不拘一格的思路,才给予了我无尽
的启迪,使我得以顺利的完成了整个试验与论文.
感谢曾授课于我们的荣廷昭院士,任正隆教授,李晚忱教授,牛应泽教授,曹墨菊副教授,杨先
泉副教授,唐祈林副教授,佘跃辉副教授,杨世民副教授,晏本菊副教授,廖老师…… 你们严谨务实,
勇于创新的治学态度,踏踏实实的工作作风以及无私的奉献精神,给我留下了深刻印象并将使我终身受
用!
感谢所有关心,支持我的亲人,朋友和同学!谢谢你们!
唐 杰
2006年6月 雅安