从土壤中筛选分离苏云金杆菌（Bt）菌株
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Bt菌株 苏云金杆菌 微生物学 从土壤中筛选分离苏云金杆菌（Bt）菌株
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1培养基
液体LB培养基:蛋白胨10 g / L,酵母粉5 g / L,NaCl 10 g / L,pH 7.0-7.2;
固体LB培养基:在液体LB培养基中加入琼脂20 g / L ;
1/2 LB培养基:蛋白胨5 g / L,酵母粉2.5 g / L,NaCl 5 g / L,pH 7.0-7.2,琼脂20 g / L.
1.1.2药剂
2 M NaAc;
100 mg / ml青霉素钠盐;
复红染色剂(100 ml):碱性品红0.1 g 溶于10 ml酒精(95 %),再加90 ml苯酚(3 %水溶液).
1.1.3 对照菌株
以大肠杆菌(Escherichia coli),蜡质芽孢杆菌(Bacillus subtilis),枯草芽孢杆菌(Bacillus cereus)和B. thuringiensis HD-1标准菌株为对照,进行分离培养基和分离方法的选择.大肠杆菌JM109 菌株,枯草芽孢杆菌T-HW3菌株HD-1 菌株为本实验室保存,蜡质芽孢杆菌为福建农林大学胡方平教授赠送.
1.1.4 分离材料
从武夷山自然保护区,泰宁状元岩,三明麒麟山,永安桃源洞,福州森林公园,鼓山,长乐,永泰,闽清等福建省内各地区采集25种植物的叶片样本127份进行Bt的分离.
1.2 试验方法
将采回的叶面研磨,取0.1g装入容量为250 ml三角瓶中,三角瓶装有10 ml LB液体培养基及不同配比的抗生素和醋酸钠,于28～30 ℃,250 r/min条件下摇瓶4 h,取200 μl悬浮液80 ℃水浴3 min,立即冰浴,解冻冰浴的样本,涡旋1 min,悬浮液在4100 g离心15 min,沉淀溶于1 ml无菌水,在10,000 g离心5 min,沉淀溶于200 μl无菌水,稀释培养72 h后, 观察具有Bt形态特征,如白色糙面,边缘整齐或不整齐,圆盘状直径可达1 cm的菌落[6].挑取这些细菌于LB平板上划单菌落培养24 h,-4 ℃保存.
1.2.4 镜检
1.2.4.1 培养
挑取需检测的单菌落用1/2 LB培养基培养3 d.
1.2.4.2 染色
在干净的玻片中央滴一滴蒸馏水,用接菌环从单菌落上挑取适量菌体涂于蒸馏水中,玻片于酒精灯上来回过热两次,使菌固定,待玻片充分风干后,加复红染色剂染色30 s,用水缓慢冲去染色剂,凉干后油镜下检测是否存在形芽孢和伴孢晶体,通常Bt芽孢为透明椭圆形状,伴孢晶体紫色,呈圆形,椭圆形,菱形,双锥形,不规则等形状.有以上特征的菌株可初步鉴定为Bt分离株,保存备用.
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