实验一、植物有丝分裂标本制备与染色体核型分析（6学时）（综合实验）

实验一、植物有丝分裂标本制备与染色体核型分析（6学时）（综合实验）

掌握植物根尖染色体制片技术，观察分析植物细胞有丝分裂各时期细胞及染色体形态、中期染色体的长短、臂比和随体等形态特征，学习染色体核型分析的方法。

第一部分 植物染色体压片法

一 实验目的

1. 学习并掌握根尖处理、染色、压片及制片观察的方法。

2. 观察有丝分裂各时期染色体的形态变化，了解有丝分裂全过程。

二 实验原理 

高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎尖生长点及幼叶等器官的分生组织(分生区)，其中根尖是最常用的材料：

①根尖取材容易，操作和鉴定也比其它器官与组织方便；

②实验室内采用种子萌发后所长出的新鲜幼嫩根尖，不受植物生长季节的影响和限制，并且可以大量获得；

③对于某些珍贵而又稀少的试验材料，取用自然条件下生长植株的根尖，比取用茎尖、花器等对材料的伤害要小得多；

④采用实验室内种子发根，切取根尖后的种苗通常还可以进行正常种植，利于后续研究进行。

有丝分裂期在整个细胞周期中所占的时间相对较短，有丝分裂制片的主要目的是进行染色体鉴定，希望观察到更多分裂相，尤其是分裂中期相，通常要对材料进行不同的预处理。

预处理主要通过抑制和破坏纺锤丝的形成来获得更多的中期分裂相；同时，预处理还可改变细胞质的粘度，促使染色体缩短和分散，便于压片和观察。常用的预处理有物理法、化学法、混合处理法等。

植物细胞的细胞壁对细胞形态和结构起支撑和保护作用，分生组织的细胞壁结构将分生细胞结合成一个整体，因此在压片之前需要采用适当方法软化或部分分解细胞壁使细胞间易于分离，这一操作称为解离。同时，解离也可适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，便于观察染色体。常用的解离方法主要有酸解法和酶解法。

酸解法：步骤简便、容易掌握。根尖分生组织经过酸解和压片后，呈单细胞。酸解法广泛用于染色体计数、核型分析和染色体畸变的观察及相关分析。

酶解法：常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交换研究。通过解离和压片，分生细胞的原生质体能够从细胞壁里压出，使染色体周围不带有细胞质或仅有少量细胞质，让后续制片处理直接作用于染色体。

在普通光学显微镜下观察染色体形态结构还需要对材料进行染色，通常采用染色体染色效果好而细胞质着色少的碱性染料、酸性染料或孚尔根试剂染色。

三 实验材料

蚕豆(Vicia faba, 2n=2x=12)根尖

四 实验器具、试剂

显微镜、恒温箱、水浴锅、计时器、培养皿、酒精灯、小烧杯、试管、载玻片、盖玻片、镊子、剪刀、刀片、解剖针、吸水纸、纱布、标签纸、铅笔、橡皮等常用工具。

0.1％秋水仙碱，或饱和对二氯苯溶液，卡诺氏固定液，改良石炭酸品红染液，冰乙酸，甲醇，无水乙醇，95％乙醇，0.1％升汞，１mol/L盐酸。

五 实验方法

1．发根

将蚕豆种子用0.1％升汞消毒10min，经流水冲洗，温水浸泡1～2d后，置25℃恒温箱中发根。待主根长到2cm左右时剪去主根（须根系植物的种子发出的主根不需剪掉），让其充分长出侧根。待侧根长到1～2cm时，于适宜时间用蒸馏水洗净，将水吸干，剪取根尖0.5～1cm进行预处理。为获得尽可能多的分裂相，蚕豆根尖以上午9～10时剪取为宜。

2．预处理

将剪下的根尖立即放入0.1％秋水仙碱或饱和对二氯苯水溶液中，以药液浸没根尖为度，处理3～4h。抑制和破坏纺锤丝的形成，使根尖细胞延迟其染色体的分离，增加中期分裂相，并使染色体分散于细胞中，以便观察计数。

3．固定

材料经预处理后，用流水冲洗，然后投入卡诺液Ⅰ（3份甲醇∶1份冰乙酸，现配现用）中固定20～24h，用95％的乙醇洗两次，转入70％乙醇中保存备用。固定的目的是将材料迅速杀死，并使染色体形态、结构尽可能保持不变和便于染色。

4．解离 

常用酸解法：从70％乙醇中取出固定好的根尖→流水冲洗３min→吸水纸吸干→放入盛有适量1 mol/L HCl，60±0.5℃水浴保温的青霉素瓶中→解离10min。

5．染色  改良石炭酸品红染色：

解离后材料水洗3min并吸干，取1/2个根尖的乳白色分生组织于载玻片上夹碎捣烂，滴加1～2滴染液，染色10～15min，压片。

6．压片 

在经染色的材料上加一滴染液，盖上盖玻片，覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打，或以拇指垂直紧压盖片(注意勿使盖片搓动)，使材料分散压平，便于观察。

7．镜检 

通常染色清晰而又分散得很好的分裂相只是少数，因此压片后要认真仔细地进行镜检。先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察、记数或拍照。调节可调节可变光栏与反光镜，使光线明暗合适，视场亮度适中。注意观察有丝分裂全过程的染色体形态变化，找出染色体分散好的中期细胞进行染色体计数，对好的分裂图像作上标记，以便再观察。

8．封片保存

如制片标本符合要求，则把玻片放在干冰或冰箱中冻结，然后用刀片迅速把盖玻片和载玻片分开，用电吹风吹干玻片，经二甲苯透明后，滴中性树胶，加盖玻片封片，制成永久制片。

制作完成的制片标本要贴上标签，注明材料名称、可观察到的有丝分裂典型时期、制片时间、制作者等信息。

六.结果

间期：在光学显微镜下，只看到均匀一致的细胞核及许多的丝状染色质。实质上间期的核是处于高度活跃的生理生化的代谢阶段，正为细胞分裂准备条件。

前期：核内染色质逐渐浓缩为细长而卷曲的染色体，每一染色体含有两个染色单体，它们具有一个共同的着丝点；核仁和核膜逐渐模糊不明显。

中期：核仁、核膜逐渐消失，各染色体排列在赤道板上，纺锤丝与染色体的着丝点相连。染色体分散，易于鉴定形态、数目。

后期：各染色体着丝点分裂为二，其每条染色单体也相应地分开，并各自随着纺锤丝的收缩而移向两极，每极有一组染色体，数目和原来的相同。

末期：分开在两极的染色体各自组成新的细胞核，在细胞质中央赤道板处形成新的细胞壁，使细胞分裂为二，形成二个子细胞。这时细胞进入分裂间期。 

七 作业

１．制作细胞有丝分裂前、中、后、末各期的制片一张，中期应能数清染色体数。贴上标签，注明材料名称，染色方法，制片日期和制作者姓名。

2．绘制所观察到有丝分裂典型时期的染色体图像，并简要说明各时期染色体的行为变化和特征。

八.注意事项

1.酒精和解离液都要清洗干净，并认真吸干，否则影响染色效果。 

2.染色时间10分钟是个参考时间，应以实际染色效果判断，不太长也不能太短。 

3.镊子敲打时，应用力均匀，开始不要太重，避免细胞挤压在一起。用力太轻不易使细胞处于同一平面，故应适当控制敲打力度。

第二部分 染色体核型分析

一 实验目的

1．学习和掌握核型分析的方法。

2．进一步了解染色体形态特征、在细胞分裂中的联会形象以及染色体组、核型及染色体数目、结构变异与生物进化的关系。

二 实验原理 

因为核型分析能明确识别各个染色体的特征，通过核型分析可以了解不同物种、同一物种不同亚种、或家畜不同品种甚至同一品种不同个体之间染色体结构的差异，有助于基因定位及其它遗传分析。

三 实验材料

黑麦(Secale cereals, 2n=2x=14)根尖有丝分裂中期照片

四 实验器具、试剂

不锈钢尺，小剪刀，小镊子，绘图纸，粘剂，座标纸等。

五 实验方法

1．准备染色体标本的相片  将制作的细胞轮廓清楚，染色体集中而不重叠，主、次缢痕和随体清晰，染色体长度适中而不弯曲的染色体标本，通过显微摄影（或描绘）、冲洗、放大成染色体相片。

2．染色体测量  目测相片上每条染色体长度，按长短顺序初步编号，写在每条染色体相片背面，用钢尺逐个测量每条染色体长度（总长、长臂长、短臂长），换算出各条染色体的相对长度、臂比及着丝粒位置，有随体的染色体，其随体长度和次缢痕长度可计入全长，也可不计入，但必须加以说明。将测量和计算的数据分别记录如表1-1和表1-2。

用测微尺直接测量中期染色体长度：

如果自己的制片很好，可以直接测量，然后统计计算。

染色体总长度：整个染色体组全部染色体长度之和。

相对长度：每一条染色体的长度与总染色体长度的百分比。

臂率：长臂长度与短臂长度之比。

染色体臂比值、着丝点位置与染色体类型

表1-1   核型分析实测记录表

表1-2  核型分析计算表

3．排列核型图  按上述标准及计算结果，将照片上的染色体剪贴配对，重新编号。着丝粒排在同一水平线上，短臂在上，长臂在下。排列好后进行分析比较，确定其核型是否正常。若要准确细致分析，必须进一步运用染色体显带技术。

4．绘制核型模式图  根据前面的计算结果和排列的核型图，用绘图纸和座标纸（座标纸放在绘图纸下面）绘制核型模式图。横座标为染色体序号，纵座标为染色体（臂）的相对长度，“0”为长、短臂的分界线，长臂在下，短臂在上。按短臂长度从长到短排列。

六.结果

七 作业

1．制作染色体核型图，并绘制染色体模式图。

2．简要描述实验所测核型的分析结果。

各个时期图片：间期   前期  中期  后期  末期