实验目的
1.能独立的进行细胞技术,会绘制生长曲线,了解细胞生长的发育特性。
2. 学习在科研中如何应用生长曲线。
实验原理
生长曲线的测定(计数法)是测定细胞绝对生长数的常用方法,也是判定细胞活力的重要指标,为培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后,经过短暂的悬浮然后贴壁,随后度过长短不同的潜伏期,即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后,停止生长,进入平顶期,然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中的细胞数目的动态变化,需连续对细胞进行计数,通常计数7天。为精确起见,一般每次计数三瓶细胞并取平均值。典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期,成平台状的平顶期及退化衰亡四个部分。以存活细胞数对培养时间做图,即生长曲线。
生长曲线常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。一般在对数期的1/3-1/2处加药。细胞技术的时间和次数依实验目的而定。
另外,测定生长曲线的常用方法还有MTT法。
实验步骤
1. 胰酶消化细胞(一般用三种细胞,本实验用Hep2,Mel,CHO,本实验组用CHO),用新培养基中止,制成细胞悬液,吹打均匀,计数。
2.根据计数结果,每个方瓶中接细胞3×105个,加3mL培养基。一种细胞接15瓶。用作对照组4瓶,三个药物梯度(5、10、15ug/mL)各三瓶,2瓶备用。(本实验组因为细胞有限,故只接了7瓶,对照四瓶,10ug/mL三瓶)
3.24h后,计数1瓶细胞(相当于所有的瓶子的细胞都以这个数计算),分别加药。
4.48h、72h、96h后,分别计数,每个药物梯度和对照组各计一瓶。
5.计数是,用胰酶消化稍过一点。用原培养基中止消化。(这样做可以防止细胞损失)用27uL细胞和3uL台盼兰染色计数活细胞。要定容培养基的量(加入胰酶后的体积)第5步不用再超净台中完成。
6.以细胞数为纵轴,以时间为横轴作图。