目前国内外常用的转基因检测方法大致分为两个方向,一是以检测外源基因为目标,二是以检测外源蛋白为目标。
常用的针对外源基因的检测方法有:定性PCR,实时荧光定量PCR法[5~7],基因芯片检测法,多重连接依赖的探针扩增法(MLPA)[8,9]等。由于植物转入的基因成分一般包括启动子(promotor)、报告基因(reporter gene)、目的基因(target gene)和终止子( terminator) ,其中启动子和终止子为表达目的基因所必需[10]。目前,转基因植物所采用的启动子主要为来源于花椰菜花叶病毒的Camv35s启动子、根瘤农杆菌的nos启动子及玄参花叶病毒的FMV35s启动子;广泛应用的终止子分别来源于根瘤农杆菌的nos终止子、花椰菜花叶病毒的camv终止子以及新霉素磷酸转移酶NptII终止子[11]。针对这些基因利用PCR扩增来检测转基因植物。
利用PCR方法进行检测是高灵敏度的DNA水平检测, 但常伴有各种假性结果出现: (1) DNA提取时产生的各种反应抑制因子,使PCR呈假阴性; (2)产品深加工时核酸被破坏成碎片,含量极低,使PCR呈假阴性; (3)当作物受到花椰菜花叶病毒的感染而带有35S启动子或因农杆菌感染而带有nos终止子时,PCR呈假阳性; (4)实验室的残留污染使检测结果呈假阳性;(5)在收获、运输或加工过程中转基因食品与非转基因食品产生交叉污染也会使检测结果不准确[12]。
由于绝大多数转基因植物都以外源结构基因表达出蛋白质为目的, 因此,也可以通过对外源蛋白质的定性定量检测来达到转基因检测的目的。目前常用的蛋白质检测方法均以免疫分析技术为基础。免疫分析技术具有高度特异性, 即便有其他干扰化合物的存在, 特异性抗原抗体也能准确地结合。常用的外源蛋白检测方法有Western 印迹法和酶联免疫吸附法(enzymel-inked immuno sorbent assay ,ELISA)。Western 印迹法技术是利用SDS 聚丙稀酰胺凝胶电泳分离植物中各种蛋白质,随后将其转移到固相膜上进行免疫学测定,据此得知目的蛋白表达与否、大致浓度及分子量。具有很高的灵敏性,可从植物细胞总蛋白中检出50ng的特异蛋白质,若是提纯后的蛋白质,可检出1~5ng。但操作烦琐,费用较高,不适于检验机构批量检测。ELISA 是免疫反应和酶高效催化反应的有机结合[13,14],一般为定性检测,但若作出已知转基因成分浓度与OD值的标准曲线,也可根据标准曲线,由未知样品的OD值来确定此样品的转基因成分的含量,达到半定量测定的目的。Urbanek-Karlowska等利用ELISA法从作物中检测到了Bt蛋白;Rogan等利用ELISA法从作物中检测到了PAT蛋白;Lipp等利用ELISA法从作物中检测到了EPSPS蛋白。
目前转基因植物中的Bt蛋白的检测均采用免疫学的方法,但已经商业化的检测试剂盒多为国外所有,且均为多克隆抗体,不能够区分出Cry