通常在做纯化前对自己的目标物质特性了解越多对纯化将会越有利,如果不太了解,也可以通过电泳知道目标物质和杂质的情况,找到一种简单的鉴定方法,此外在纯化前必须先建立可靠的活性测定的方法。如果是未知的蛋白,那么通常可以有几种简单的摸索:
1.凝胶过滤色谱。这个方法很常用,但是效率不高,对低浓度的样品没有富集作用,上样量小。
2.离子交换色谱。此法很常用,但是样品必须没有高浓度的盐。
3.疏水色谱。此法较好,它分离效率高,上样量大,特别适合分离盐析沉淀的样品。
4.亲和色谱。是最有效的手段,关键了解目标物质的特性以便选择合适的亲和色谱填料。
二、主要用途介绍
1.去除内毒素
内毒素也叫热源,一般是磷脂A ,糖类和蛋白,在中性条件下带有负电荷。内毒素的磷脂部分有很强的疏水性,一般的在高盐情况下它们会聚合,所以不能用疏水色谱,如果蛋白本身的疏水性强, 可以选择把目标蛋白结合到疏水色谱填料(苯基琼脂糖凝胶FF ,丁基琼脂糖凝胶FF )上和内毒素分离。
内毒素因为带有很强负电荷,如果目标蛋白带阳电荷,用DEAE 琼脂糖凝胶FF 或Q 琼脂糖凝胶FF 把内毒素吸附,达到去除内毒素的目的。如果目标蛋白带阴电荷,可以尝试用阶段或梯度洗脱的方法把它们分离。
其中最有效而特异的方法是用亲和色谱填料去除内毒素,为此专门开发了两种专门去除内毒素的色谱填料,去内毒素琼脂糖凝胶FF 和高效去内毒素琼脂糖凝胶FF 可以很方便去除内毒素,其应用简单,效果明显,样品回收率高。方法是把适量的色谱填料加到样品中4 度震荡40h 左右无菌过滤就可以得到热源符合要求的样品,或者直接装柱然后循环上样8 小时左右即可。
2.去除核酸
大量的核酸会使样品的粘度增加,影响传质从而影响分离效果,此外在药品检验中也对核酸的含量有严格的规定,所以去除核酸非常重要。
核酸带有阴性的电荷,可用阴离子交换色谱填料DEAE 琼脂糖凝胶FF 或Q 琼脂糖凝胶FF 去除,也可用阳离子色谱填料: SP 琼脂糖凝胶FF 或CM 琼脂糖凝胶FF 直接把目标蛋白吸附而去除核酸。在2M 硫酸铵的条件下,RNA 和DNA 都可以被苯基琼脂糖凝胶FF 吸附。
此外也可以用核酸酶处理样品,把核酸降解成小片段,用凝胶过滤就可以去除。此外也可以本公司的DNA 纯化琼脂糖凝胶FF 去除。
3.纯化硫酸铵沉淀样品
硫酸铵沉淀是很常用的初分离的手段,这样沉淀后的样品可直接用苯基琼脂糖凝胶FF 或者是丁基琼脂糖凝胶FF 分离,不用除盐,非常方便。疏水色谱已经得到大规模的推广和应用,是很好的纯化的手段。此外疏水色谱也可以用于天然产物的分离纯化,包括多肽、色素等各种 物质的分离纯化,它的分离原理和反相色谱相同,但是不同于硅胶色谱填料的是它对样品几乎没有死吸附,所以回收率高。
4.糖蛋白的纯化
偶联各种凝集素的琼脂糖凝胶FF 的亲和色谱填料可以分离各种糖蛋白,例如Con A 琼脂糖凝胶FF 可以纯化糖基化的蛋白,或者膜组分,甚至细胞等物质。此外硼酸琼脂糖凝胶FF 也用来分离各种多糖和糖蛋白,其原理是苯硼酸类似于凝集素可以和各种糖基上的邻二羟基发生亲和作用。